骨髓间充质干细胞(BoneMesenchymalStemCells,BMSCs)是骨髓内除造血干细胞之外的另一类非常重要的成体间充质干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，具有支持和调控造血的作用，能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞等多种细胞类型。
大鼠骨髓间充质干细胞的分离及培养技术
一、实验前准备
实验开始前，将眼科剪刀、眼科镊子、培养皿，15ml离心管、移液管、移液枪、枪头等放入无菌超净工作台，以紫外线照射30min。
1.选取SPF级，体重~g左右的SD大鼠，断颈处死。将大鼠置于体积分数为75%的乙醇中浸泡5min。
2.工作台紫外消*后，采用通风机通风3min。以75%酒精擦拭操作台和双手。
3.无菌条件下，准备好大剪刀、止血钳、眼科剪刀、眼科镊子、干净培养皿。将大鼠仰卧在超净台内的干净培养皿上。
二、全骨髓提取
1.眼科镊沿腹股沟处提拉大鼠皮肤，眼科剪刀剪开腹股沟皮肤，暴露腿部肌肉，从关节处将大鼠大腿剪下。除去骨表面附着的软组织，置于另一无菌培养皿中。
2.假如在平时操作中，剪刀不易将骨表面肌肉组织剔除干净，可采用无菌纱布擦拭，可方便的将肌肉组织剔除干净，提高所分离细胞的纯度。
3.用无菌PBS浸泡清洗。眼科剪剪断两端骨骺，显露骨髓腔，放置于10ml含体积分数为10%胎牛血清的新鲜DMEM完全培养液的无菌培养皿中，取出1mL注射器，用镊子钳起骨头的一端，并用注射器吸取完全培养液冲洗骨髓腔至另一培养皿中，由一段骨髓腔冲出骨髓，重复3次，再反方向冲出骨髓，重复3次。直至骨髓腔冲洗液变清亮后停止。
三、细胞制备
吹打细胞悬液，以便分散细胞，收集骨髓悬液于15mL离心管中，0r/min室温离心5min。
四、接种培养
1.离心后去上清，用6mL完全培养液重悬，轻轻吹打，制成单细胞悬液，转移至25cm2饱和湿度培养箱中培养。3.24小时后，镜下观察，可见细胞浓度极大，全为球形的大鼠骨髓中的血红细胞，如堆积的沙粒状，悬浮于培养液中并有少量血红细胞相互聚集发生。换液，去除漂浮的血细胞，以后每两三天换液1次，直到增殖达到融合。4.约7天后，倒置显微镜下观察细胞形态与生长情况，可见贴壁细胞数量明显增加，融合达80%~90%，可进行细胞传代。
五、细胞传代
待细胞融合至80%~90%开始传代，吸去培养液，以预热的PBS轻轻冲洗后，吸去PBS。采用消化液消化1-2分钟，骨髓干细胞贴壁特性强，比较难于消化，消化液可采用提高EDTA浓度的方法，镜下可见细胞皱缩变圆，终止消化。本实验的消化液配方可以很好地消化，并不会损伤细胞。除消化液特殊外，其他方法同本光盘内的细胞传代方法。
本实验以1：2进行传代。
六、细胞观察
细胞传代到第3代时，生长融合后，细胞形态均一，呈长梭形集落样分布，并可重叠生长，细胞纯度可达95%以上。此时细胞可用于后续实验，或采用表表面标志物进一步验证其纯度：验证标准为CD34阴性，CD44阳性。
从本实验结果中可见：全骨髓培养法可分离培养出纯度高、活力旺盛的骨髓间充质干细胞。
七、注意事项
1.缓慢冲洗骨髓腔：
冲洗骨髓腔时为了避免冲起许多气泡损伤细胞，应缓慢冲洗。2.严格无菌：
取骨髓间充质干细胞的整个过程都需要谨慎，保证无菌操作3.培养基中血清浓度：
过多的血清中细胞因子可以促进细胞增殖，但细胞老化也快。而且一般来说，选择质量好10%的胎牛血清有利于MSCs的培养4.原代细胞静置培养：
原代细胞置于培养箱24～48h内，应处于静置状态，不宜取出培养瓶观察生长状况，这将使原代分离细胞难以贴壁。
作者：海星生物
